pROJET INDIVIDUEL – WORK PACKAGE 3: Neuroimmunologie 

INTRODUCTION 

En terme de fréquence, la maladie de Parkinson (MP) est la deuxième maladie neurodégénérative. De nombreux gènes familiaux clés de la MP possèdent un rôle commun dans la régulation des fonctions mitochondriales et dans la survie des neurones dopaminergiques (DA) de manière cellulaire autonome. Cependant, les mécanismes moléculaires détaillés qui sous-tendent la pathogenèse de la MP nous échappent encore largement. La découverte récente d’un système lymphatique méningé fonctionnel (Louveau et al., 2015) attire de plus en plus l’attention sur la sous-estimation du rôle des cellules immunitaires périphériques dans la pathogenèse des maladies neurodégénératives. Notre ensemble de données non publiées (Danileviciute et al, 2019, Biorxiv) montre qu’un gène familial clé de la MP est vital pour la modulation des systèmes immunitaires périphériques, et ce à la fois chez la souris et chez les patients présentant une déficience de ce gène. Dans ce projet, nous prévoyons d’étudier la contribution de ce gène spécifique à la pathogenèse de la MP par le biais de l’immunité adaptative (IA). En cas de succès, ce gène pourrait servir de modèle pour les autres gènes liés à la MP et ouvrir de nouvelles perspectives pour des traitements de la MP. 

OBJECTIF ET HYPOTHESE 

Comme indiqué ci-dessus, nous pensons que la dérégulation du système immunitaire observé chez les souris knock-out (KO) et les patients atteints de la maladie de Parkinson pourrait contribuer à la pathogenèse de la MP. Nous prévoyons donc d’étudier son rôle causal potentiel dans la pathogenèse de la MP. 

METHODES 

Nous utiliserons diverses lignées cellulaires de knock-out conditionnel dans les sous-ensembles immunitaires et les neurones DA pour discerner la contribution pathogène de l’IA des effets autonomes des neurones DA. Dans les modèles murins, nous analyserons non seulement la cellularité et les fonctions de divers sous-ensembles immunitaires, mais aussi divers phénotypes neurologiques liés à la MP, tels que les troubles moteurs potentiels, les modifications des cellules TH+ parmi les neurones DA et autres. Nous utiliserons également des modèles basés sur des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) dérivées de patients pour étudier l’effet du gène en question. 

INTRODUCTION 

La perte de fonction de DJ-1 est associée à la maladie de Parkinson (MP) autosomique récessive à début précoce. La DJ-1 est exprimée de manière ubiquitaire dans le système nerveux central (SNC) et agit comme un capteur redox intracellulaire essentiel à la neuroprotection (Cookson, 2010). L’absence de protéine DJ-1 fonctionnelle rend les fonctions dopaminergiques nigrostriatales dysfonctionnelles (Goldberg et al., 2005). La mesure avec laquelle la perte de DJ-1 in vivo modifie la fonction de la microglie reste encore peu comprise. 

Nos résultats préliminaires indiquent que la microglie des souris DJ-1 KO présente des programmes transcriptionnels spécifiques qui sont différents de ceux des souris de type sauvage avec et sans activation immunitaire. 

OBJECTIF ET HYPOTHESE

Notre objectif est de caractériser les programmes transcriptionnels et l’activité immunologique de la microglie dans des configurations déficientes en DJ-1, et ce en condition d’homéostase et d’inflammation. Nos résultats préliminaires nous conduisent à supposer que l’état d’activation/d’alerte chronique de la microglie associé à une déficience en DJ-1 pourrait contribuer à l’apparition et à la progression de la MP. 

METHODES 

Nous exploiterons la souris DJ-1 KO (Pham et al., 2010) et des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) provenant de patients atteints de la MP et souffrant d’une déficience en DJ-1. Nous isolerons les microglyocites de cerveaux murins par tri cellulaire activé par fluorescene (FACS) (Sousa et al., 2018) et dériverons les microglyocites des iPSC (Haenseler et Rajendran, 2019) pour des analyses transcriptionnelles et fonctionnelles (p. ex., phénotype mitochondrial dans les neurones dopaminergiques, profilage métabolique et réponse au stress) à une résolution cellulaire unique. Notamment, l’utilisation de la microglie dérivée des iPSC ouvrira la voie à de futurs criblages de médicaments, qui visent à restaurer les phénotypes homéostatiques de la microglie chez les patients atteints de la MP. 

INTRODUCTION 

Récemment, plusieurs formes génétiques de la maladie de Parkinson (MP) ont été associées à des processus neuroinflammatoires (Grunewald et al., 2019). Il a été démontré que les schémas moléculaires liés aux dommages dérivés des mitochondries, tels que les espèces réactives de l’oxygène (ERO) ou l’ADN mitochondrial circulant acellulaire (ccf-mtDNA), activent la voie cGAS-STING (Sliter et al., 2018) ou initient directement la formation de l’inflammasome NLRP3 (Wei et al., 2019). La maturation des cytokines inflammatoires est médiée par ces deux processus (Labzin et al., 2018). Nos propres analyses préliminaires dans le sérum de patients atteints de MP de type PINK1 et de type Parkin fournissent des preuves qu’un lien existe entre le génotype, l’état de la maladie, les taux de ccf-mtDNA et les concentrations d’IL6. Les analyses de séquençage du mtDNA dérivé du sang ont également révélé une relation entre les dommages intracellulaires du mtDNA et la libération de cytokines chez ces patients.  

De même, en évaluant l’intégrité du mtDNA chez les porteurs de mutations LRRK2 l’exprimant ou non, nous avons constaté une accumulation de délétions somatiques du brin lourd dans ce dernier groupe (Ouzren et al., 2019). Bien que ces données étayent le rôle que jouent la voie cGAS-STING et la signalisation NLRP3 dans la MP, nous ne disposons pas encore de preuves concernant les neurones et la glie dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC). En outre, nous ne savons toujours pas si l’activation des voies pro-inflammatoires est un phénomène propre à la MP de type PINK1, Parkin et LRRK2. 

OBJECTIF ET HYPOTHESE

Nous formulons l’hypothèse que la signalisation inflammatoire constitue un lien entre le dysfonctionnement mitochondrial et la neurodégénérescence dans la MP et que ce lien moléculaire peut être ciblé par des régimes thérapeutiques anti-inflammatoires personnalisés. Pour vérifier notre hypothèse, nous avons défini les objectifs suivants pour ce projet de doctorat : (i) réaliser un phénotypage mitochondrial et (ii) évaluer la voie cGAS-STING et la signalisation de l’inflammasome NLRP3 dans la microglie de porteurs de mutations Parkin, PINK1 et LRRK2. (iii) étendre ces travaux à la microglie de patients présentant des mutations dans le piégeur d’ERO DJ-1. (iv) Enfin, nous utiliserons ces modèles de microglie récemment mis en place pour cribler des composés anti-inflammatoires susceptibles d’interférer avec la signalisation cGAS-STING ou NLRP3 et de réduire la libération de cytokines. 

METHODES 

Les expériences comprendront la génération de cellules de type microglie à partir d’iPSC humaines, ainsi que des analyses transcriptomiques et protéomiques de cibles inflammatoires clés en recourant aux méthodes de RNAseq, de Western blot et d’ELISA. En outre, nous utiliserons la microscopie confocale et des techniques avancées d’analyse d’images automatisées pour déterminer l’activation et la viabilité des cellules. Le criblage des médicaments anti-inflammatoires approuvés par la FDA sera effectué sur une plateforme automatisée à haut contenu/haut débit pour les modèles cellulaires dérivés des iPSC. 

INTRODUCTION 

La maladie de Parkinson (MP) est, après la maladie d’Alzheimer, la deuxième maladie neurodégénérative la plus répandue. Bien qu’il soit désormais largement admis que la MP est un trouble « systémique » complexe, la dégénérescence des neurones dopaminergiques dans le locus niger du mésencéphale est la caractéristique principale de la maladie. Cette dégénérescence entraîne une baisse de la concentration du neurotransmetteur libéré dans le striatum. Une autre caractéristique neuropathologique clé de la MP est l’apparition de la pathologie dite de Lewy. Cliniquement, la MP se caractérise par des symptômes moteurs tels que la rigidité, la bradykinésie, le tremblement et l’instabilité posturale. Ces symptômes moteurs sont souvent précédés de symptômes non moteurs comme l’hyposmie, la constipation, des troubles du sommeil et la dépression. La microglie a déjà été décrite comme jouant un rôle essentiel dans la pathogenèse de la maladie de Parkinson. Les microgliocytes sont les cellules immunitaires innées du cerveau. En tant que première ligne de défense du système nerveux central, elles jouent un rôle crucial en cas d’infections, mais elles ont également un rôle physiologique dans l’homéostasie, le maintien et le fonctionnement des synapses. Elles peuvent en outre avoir des effets délétères (phénotype pro-inflammatoire) ou positifs (phénotype pro-régénératif) dans différents types de troubles cérébraux. Des protocoles décrivant la microglie dérivée d’iPSC humains ont récemment été décrits. 

OBJECTIF ET HYPOTHESE

Nous supposons que la dérégulation de l’autophagie dans les microglicytes spécifiques aux patients atteints de la MP contribue à leur activité délétère au cours de la progression de la maladie. Par conséquent, notre objectif dans ce projet est de dériver des microgliocytes à partir d’iPSC provenant de patients de la cohorte NCER-PD. Les patients qui présentent un phénotype immunitaire (p. ex. des taux élevés de certaines interleukines) seraient particulièrement intéressants dans ce contexte. Ce projet s’inscrit dans le cadre d’une initiative plus large au sein de notre laboratoire. Afin d’analyser l’autophagie chez eux, les microglies dérivées d’iPSC seront modifiées par CRISPR/Cas9 à l’aide de rapporteurs d’autophagie fluorescents. Il est important de noter que ces rapporteurs sont adaptés à l’imagerie et au criblage à haut contenu. Par conséquent, nous utiliserons ce système pour le criblage de notre bibliothèque de composés naturels disponibles afin de détecter des composés ciblant l’autophagie microgliale spécifique à la maladie de Parkinson. Enfin, après avoir identifié les composés actifs, ils seront validés dans une prochaine génération d’organoïdes cérébraux contenant des microgliocytes et spécifiques aux patients atteints de la MP. Le projet sera mené en étroite collaboration avec l’initiative NCER-PD et la sélection des patients sera basée sur les données cliniques de la cohorte (collaboration avec R. Krueger).  

Le doctorant de ce projet, selon sa formation scientifique, contribuera soit à a) la génération de microglies et à leur phénotypage, soit à b) l’analyse computationnelle d’images de microscopie à haut contenu au moyen d’approches d’intelligence artificielle. 

METHODES 

Formation en biologie cellulaire/immunologie : 

(I) la technologie iPSCi, (ii) la différenciation en microgliocytes et en organoïdes cérébraux, et (iii) l’imagerie à haut contenu et le criblage de composés. 

Formation en informatique/bioinformatique : 

(i) analyse d’images/extraction de caractéristiques, (ii) approches d’intelligence artificielle pour l’analyse des caractéristiques d’image, (iii) corrélation des données d’imagerie avec d’autres ensembles de données (p. ex., transcriptomique ou métabolomique). 

INTRODUCTION 

Le microbiome intestinal humain est un écosystème complexe, qui contribue à certaines fonctions essentielles de la physiologie humaine. Plusieurs maladies chroniques caractérisées par une inflammation, notamment la maladie de Parkinson sont associées à des modifications du microbiome. Les molécules effectrices dérivées du microbiome, qui incluent des acides nucléiques, des (poly)peptides et des métabolites, sont présentes à des taux élevés dans l’intestin, mais n’ont jusqu’à présent pas encore fait l’objet d’une étude systématique. Ce manque de connaissances limite la compréhension mécaniste de l’effet fonctionnel du microbiome sur la maladie de Parkinson, plus particulièrement la manière dont il est lié à des taux plus élevés de cytokines inflammatoires circulantes (TNF-alpha, IL-1, IL-6, IFN-gamma), de chimiokines (CXCL2, CXCL8, CXCL10) et de marqueurs d’inflammation (protéine de liaison au LPS, protéine C-réactive). 

OBJECTIF ET HYPOTHESE

L’objectif du projet est d’éclaircir le complexe moléculaire dérivé du microbiome dans l’intestin et son effet sur le système immunitaire humain dans le contexte de la maladie de Parkinson. L’hypothèse sous-jacente du projet est que les molécules dérivées du microbiome intestinal stimulent les voies de l’immunité innée et adaptative, qui déclenchent et/ou contribuent à la maladie de Parkinson. 

METHODES 

Le projet comprendra la génération, l’intégration et l’analyse de données multi-omiques quantitatives et intégrées de biomolécules extracellulaires issues d’échantillons de microbiome prélevés sur des individus en bonne santé et sur des patients chez qui un diagnosic de maladie de Parkinson a récemment été posé. Plus précisément, les données seront intégrées et analysées à l’aide d’une base de connaissances récemment créée (http://expobiome.lcsb.uni.lu). Au moyen des connaissances préalables contextualisées et de méthodes d’apprentissage automatique, le projet identifiera des molécules microbiennes associées aux immunophénotypes spécifiques à la maladie de Parkinson.